研究课题内容介绍

分析化学是构建仪器和发展检测方法学的一个重要科学分支。环境的自身演变,特别是人类活动,对环境的破坏和污染有逐渐打破环境和生命间依存平衡的趋势。其中最为突出的问题是人类活动所带来的“副产物”-环境污染,它不但影响环境自然平衡状态,而且对生长在其中的生命体包括人类自身也带来了灾难。在认识复杂环境体系中污染物质的种类、含量和分布规律,理解环境污染对生命过程的影响和生命体适应环境的自身调控机制过程中,高灵敏度高选择性的分析检测技术和相应的分析策略至关重要,实际上它们是人类认识和理解环境和生命依存关系征程中必须突破的“屏障”之一。深入开展相关基础和应用基础研究是突破这一“屏障”的必经之路。

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分析检测复杂环境体系中污染物质时,必须面对“痕量的污染物质存在于大量复杂基体中”这一现实,而且它们通常以不同的化学形态分布并呈现出迥异的物理化学行为,这正是它们所表现出的不同环境行为和生物效应之驱动力所在。更为困难的是环境体系是一个开放的动态复杂体系,其中目标污染物的量和形态处于变化之中。面对这样的情况,现有的单一检测技术和有限次数的分析测定所得到的分析结果往往不能客观地反映环境的实际污染状况以及它们对环境中生命体的胁迫程度。合适的样品采集/处理方法和高效的分离和富集手段必须与高灵敏度高选择性的检测技术相结合,才能使我们所得到的分析结果趋于实际情况,进而达到客观地“认识复杂环境体系中污染物质的种类、含量和分布规律;理解环境污染对生命过程的影响和生命体自身适应污染环境的调控机制”的目标。分析化学/科学家的梦想:“Seeing is Believing”的实现依赖于创新性的思维和策略精妙的实践。

本实验室近年来主要研究方向包括以下几个方面:

(一)复杂环境体系中痕量污染物质的含量和形态分析新技术新方法

提高分析方法的灵敏度和选择性是分析化学研究的永恒主题。高效的原子光谱/质谱进样技术和链接色谱/电泳和原子光谱/元素质谱的高效“接口”技术,不但使原子光谱/质谱具有更强的抗基体和抗光谱干扰能力和更低的检测极限,而且极大地提高了样品中目标分析物从色谱/电泳分离到原子光谱/元素质谱检测过程中的传输效率(进样效率),使原子光谱/质谱的检测能力得以充分有效“释放”,是原子光谱/质谱和色谱-原子光谱/质谱联用分析的研究热点。

1、光催化/光诱导还原:色谱-原子光谱联用的高效化学蒸气发生进样和接口新技术

我们率先发展了纳米TiO2的光催化“还原体系” :于玻璃纤维表面修饰纳米TiO2膜(150 nm/层,6-8 nm/粒径),并将其组装于石英毛细管中,制成UV/nano-TiO2光催化还原装置,以低分子量有机酸捕获h+,成功地实现了六价硒(Se VI)的预还原(传统的 NaBH4/NaOH-acid 体系不能将其有效还原为H2Se),使六价硒的还原效率由传统KBH4/NaOH-acid 还原体系的几乎为零提高至53%。作为“接口”实现了硒和汞的四种常见形态的高效液相色谱-原子荧光光谱(HPLC-AFS)分析。继而利用UV/nano-TiO2光催化还原装置为HPLC-AFS的在线“串联接口”成功地进行了硒强化培养的大蒜中硒的形态分析。

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a) 纳米TiO2光催化氧化还原机制;b) UV/nano-TiO2光催化还原装置
c) HPLC-(UV/nano-TiO2)-AFS联用装置

另一研究思路是利用“巯基-S.”自由基光诱导还原,发展蒸气发生新技术。我们认为巯基乙醇”(ME)分子中因光诱导所产生的“羟基-C.”自由基上的电子可发生分子内转移而产生 “巯基-S.”自由基,后者可用于还原汞的各种形态。实验表明,这一设想是合理的:HPLC流出液在不经UV/nano-TiO2光催化还原,仅在UV照射下,即发生Hg的还原,并在与其联用的AFS检测到还原态Hg0的信号。这意味着当Hg的各种形态与巯基乙醇共存时,在UV照射下可以被“直接还原为Hg0”。“巯基-S.”自由基光诱导还原Hg的机制被FT-IR和GC/MS所证实。这一研究结果应Ralph Sturgeon博士邀请发表于Anal Bioanal Chem的“Metal vapor generation”专刊上。

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光诱导巯基乙醇还原Hg的推测机制

2、色谱-ICP质谱联用程序升温式热扩散接口技术:环境中无机和有机汞和铅多形态同时高灵敏度高选择性分析方法学

cGC与ICP-MS联用能充分发挥cGC高效的分离能力和ICP-MS高灵敏的检测能力,是痕量元素的形态分析的高效组合技术之一,其关键是链接它们的“接口”技术。cGC与ICP-MS之间存在一个 “温度真空”区域,cGC分离后的气态的元素形态在传输到ICP-MS的过程中发生“冷凝结”效应,导致传输效率低,不能保证分离后的气态元素形态有效地传送到ICP-MS中进行检测,造成检测灵敏度低,不能发挥ICP-MS检测的超高灵敏特性。我们设计了“程序升温式‘热扩散'接口”:利用铜管高效热传导特性,将其与cGC柱箱连接,巧妙借用cGC柱箱的程序升温控制“接口”处毛细管的温度,使其与柱箱温度保持同步变化,以保证每一个cGC分离后的气态的元素形态在“接口”处的温度与其在cGC分离过程中的温度基本相同,避免了传输过程中气态分析物种的“冷凝结”,传输效率提高近2个数量级。

选择典型的环境污染元素铅和汞为模型元素,它们具有近似的污染来源,但汞在环境中趋于烷基化而铅倾向于去烷基化,表现出几乎相反的迁移转化途径,其形态分析在环境分析中具有“指标”意义。在Hg和Pb 烷基化衍生反应中常用乙基化衍生试剂,造成形态信息的丢失、不能进行铅和汞形态的全分析。我们提出采用丁基衍生化试剂,成功地实现了 Pb2+, Me3Pb+, Et3Pb+, Me4Pb, Et4Pb, Hg2+, MeHg+和EtHg+等无机和有机形态的有效区分;同时,设计合成Pr3PbCl作为内标,避免使用相应形态的多种同位素内标物,实现了铅和汞的无机和有机形态的同时全分析。部分研究结果发表于分析化学领域顶级学术期刊Anal Chem

3、脉冲式大体积进样(p LVI)-毛细管气相色谱(cGC)/电子捕获负化学离子化(ECNI)-四极杆质谱(qMS):典型环境卤代持久性有机污染物(H-POPs)分析方法学

H-POPs的同系物种类繁多、异构化程度大、含量极低,通常需要高分辨气相色谱和高分辨双聚焦质谱(HRMS)联合使用才能达到准确定量的目的。如果利用目前实验室普遍配备的四极杆低分辨质谱(qMS)检测H-POPs时,则qMS的分辨率必须进一步提高。我们创新地提出在ECNI模式下,通过监测具化合物特征的“结构特征离子”而非常规的Cl-或 Br-,弥补 q MS 分辨率的不足,使其分辨本领与双聚焦 HRMS 相媲美。但是监测“结构特征离子”qMS的灵敏度与监测Cl-或Br-时相比降低近2个数量级。我们采用p LVI的进样方式,进样量可由通常的1 μL增加至120 μL ,补偿监测“结构特征离子”时qMS灵敏度的损失。更为重要的是,监测“结构特征离子”使得在ECNI离子化模式下使用13C标记的H-POPs标准物质作为内标进行H-POPs的定量分析成为可能,分析结果的准确度亦大为提高。在保证方法选择性的前提下,检测28种典型H-POPs的灵敏度达到pg-fg/mL数量级,实现了利用普通cGC/qMS同时准确分析28种典型H-POPs的目标。这为进一步开展POPs污染的 “时空分辨”监测工作建立了可靠的分析平台。部分研究结果发表于美国质谱学会志J Am Soc Mass Spectrom

4、元素标记的多肽/蛋白质绝对定量和构象分析方法学

当生命体受到污染物的氧化或还原胁迫时,蛋白质以其二硫键(-S-S-)的“开关”来改变其构象、传导“信号”,改变相关蛋白的表达。我们尝试利用汞与多肽/蛋白质中巯基)的特异性相互作用来标记多肽/蛋白中的巯基,并通过对多肽/蛋白质中-S-S-的还原来标记所生成巯基,经电喷雾离子化离子阱串级质谱(ESI-IT-MSn)和AFS/ICP-MS对汞标记后的多肽/蛋白质进行分析可实现多肽/蛋白质中-SH和二硫键的计数和定位, -SH/-S-S-的比值反映了生命体受到环境胁迫的程度,继而获取环境污染的状况信息;另一方面,通过多肽/蛋白质上标记汞的定量检测可实现多肽/蛋白质的准确定量。发展了探测环境污染物胁迫下生物应激反应的新方法。部分研究结果发表于美国质谱学会志J Am Soc Mass Spectrom

以元素为“标签”的蛋白质定量研究的另一思路是以“内源硒元素”为“标签”。以77Se 同位素稀释,实现了血浆中 Se 蛋白(Sel-P 和 GPx)的HPLC/ICP-MS绝对定量。发展和丰富了原子光谱/元素质谱的生物分子检测策略,“释放”了元素质谱技术在生物分子定量分析中的应用潜力。研究结果发表于J Anal At Spectrom

(二)典型重金属元素和稀土元素在复杂环境 - 植物系统中的迁移和转化规律与植物自身的调控机制

生长在环境中的植物在吸收各种养分以维持正常生命活动的同时也受到各种因人类活动带来的污染物的胁迫。在同样的环境条件下,各种植物面对污染的胁迫表现出不同的抵御机制,有些植物不仅可以生存而且启动自身的防御系统,“沉睡”的基因被激活,体内开始产生/表达某种特异性多肽/酶/蛋白质,转化污染物,甚至能够超富集污染物质;相反,另一些植物则受到毒害而凋零。基于我们多年来在色谱-原子光谱/质谱领域的研究基础,运用色谱-原子光谱/质谱联用新技术新方法在分子水平上研究植物对典型重金属和稀土元素的转化规律以及植物自身的抵御或超富集机制,认识污染环境对植物生长的胁迫作用和植物自身调控机制的差异。

1、典型重金属污染元素在植物体内的转化规律和植物自身的调控机制

选择小白菜(Brassica chinensis)为模型植物,研究其在镉和汞胁迫下的“自御”机制,以理解植物对高毒性重金属污染的解毒途径和耐受能力。运用尺寸排阻色谱(SE-HPLC)与ICP-MS 和ESI-IT-MSn联用技术,考察小白菜在不同浓度Cd的胁迫下的生理反应,发现还原型谷胱苷肽(GSH)作为重要的C 载体和信号传递分子,在Cd诱导合成植物螯合肽PCs,(γ-Glu-Cys)-Gly, n=2-11)和启动抗氧化酶系统的过程中发挥着重要作用,证实了PCs的络合“钝化”作用和抗氧化酶系统协同抵御 Cd 侵害的机制;进一步的研究发现GSH是PCs合成的前体,同时根据Cd的同位素分布模式在小白菜活体中(in vivo)检测到PCs-Cd的存在,首次为PCs在小白菜抵御Cd的细胞氧化侵害过程中的络合“钝化”作用提供了直接、确切的实验证据。相关研究结果发表于J Anal At Spectrom

因汞与硫特异的共价相互作用,植物对环境中汞的吸收受含硫配体的影响很大。在半胱氨酸(Cys)和腐植酸(HA)存在的情况下,RP-HPLC/ICP-MS/ESI-IT-MSn研究显示:虽然Cys和HA的存在降低了小白菜对Hg的吸收,但增强了Hg诱导PCs在小白菜根部的合成;小白菜的根部不但发现了氧化型PC2、PC3和PC4,而且首次发现相应的 in-vivo HgPC2、HgPC3、HgPC4和Hg2PC4。这为阐明小白菜在Hg胁迫下自身的调控机制提供了实验证据。部分研究结果应邀在RSC最新学术期刊Metallomics(金属组学)创刊号上以研究报告形式发表。

另外,我们发现铜屋顶寺庙屋檐下地面上的苔藓(Scopelophila cataractae)其地上部分(shoot)可超富集Cu,含量高达18860±229 μg/g干重,且大量富集于叶绿体中。利用 HPLC/ICP-MS/ESI-MSn,发现Cu在叶绿素a(Chl-a)中以“中心离子”的形态存在,而且改变了Cu同位素的自然分布(63Cu,69.17%;65Cu,30.83%),优先选择65Cu(58.82%),表现出明显的Cu同位素分馏效应。这是Cu在自然界中作为Chl-a的中心离子的首次发现。

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Chl-a-Cu的ESI-MS质谱图

2、稀土元素生物效应和蕨类植物超富集稀土元素的机制

为了在分子水平上理解稀土的生物效应,以菠菜为模型植物,通过向Knop 培养液中加入不同量和不同形态的镧(La),研究其对菠菜光合作用的影响程度。利用不同分离模式的HPLC与ICP-MS 、APCI/ESI-IT-MSn和基质辅助解离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)联用技术,并结合菠菜生理指标的测定,首次发现La不但可以进入叶绿体而且部分地取代叶绿素a(Chl-a)的中心离子Mg,形成-[Chl-a?La?pheophytin]-的单元结构。我们推测该结构较单纯Chl-a-Mg二聚体具有更 “合适”的氧化还原性质,在光合作用电子传递链中发挥更为有效的作用。

另一方面,我们在研究稀土元素生物效应的同时,开展稀土超富集植物的探寻和富集机制的研究工作。在福建南靖自然保护区,发现一种新的稀土超富集植物——“单叶新月蕨(Pronephrium simplex)”。利用 SE-HPLC与ICP-MS、ESI-IT-MSMSn及 MALDI-TOF-MS联合检测发现了分子量为(5.07±0.02)KDa的对稀土有解毒作用的特异结合多肽(pI 3.7),且富含脯氨酸和甘氨酸。研究结果发表于J Anal At SpectromTalanta。进一步通过Nd3+胁迫培养单叶新月蕨,其特异结合多肽与Ce3+胁迫时所得到的结合多肽的分子量相差4 Da,并在其变性后脱去的肽段(632 Da)中发现了Nd的同位素分布,为稀土结合多肽的存在提供了可信的实验证据;对进一步建立单叶新月蕨的cDNA文库,找出与稀土结合多肽表达的相关基因,并利用转基因技术进行适于通常环境条件下生长的大生物量植物的遗传转化,最终应用于实际污染土壤的植物修复,提供了必要的理论和实验积累。

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Nd 结合多肽片段的SE-HPLC/ESI-IT-MS质谱图

(三) 大气持久性有机污染物(POPs)的 “空间分辨”和“时间分辨”分析方法学

我们认为生长在环境中并广泛分布的多年生木本植物具有“空间”和“时间”分辨特性,可能会提供“目前所采用的“主动式”、“短时间”的大气样品采集方法能否客观反映大气污染的真实状况”这一问题的解决方案并填补我国大气污染的历史数据的“空白”。为此,率先开展了树木表皮富集大气POPs机理的基础研究和大气POPs污染空间分布和历史演变趋势的应用研究。

我们注意到,生长在环境中的树木实时暴露于大气中,由于其表皮的脂质含量高且多孔、比表面积大,能实时富集大气中的POPs。为了使树木表皮这一大气POPs的被动采样介质能够真正应用于实际的大气POPs污染监测工作中,我们首先开展了相关的基础研究。相关性实验证实:表皮中 PAHs 的含量与大气中PAHs的量间的相关系数大于0.9,而与土壤中的PAHs含量间的相关系数接近0(不相关),表明树木表皮是一个大气POPs的“专属”采样介质。通过研究大气PAHs在树木表皮中的富集机制,证明美国环境保护局16种优先检测的PAHs以两种途径在树木表皮中富集:①气态 PAHs 与表皮中的脂质类物质相互作用,富集程度与其辛醇-空气分配系数(Koa)相关;②通过表皮上“皮孔”物理捕集的颗粒态 PAHs,其富集程度与蒸气压(Vp)相关。进一步说明树木表皮是一种大气POPs的“专属”采样介质,其中POPs的含量可以全面地反映大气POPs的污染程度。相关研究结果发表于环境科学领域的顶级学术期刊Environ Sci Technol

为了消除以不同地点采集的树木表皮样品中POPs含量的相互比较来评价不同地点的大气 POPs污染程度存在的“不确定性”,我们提出大气POPs富集过程的“自然内标”(natural internal compound, NIC)概念,选择自然来源的“苝”(PER)作为大气 PAHs 富集过程的 NIC,以表皮中目标PAHs和PER的浓度(BMC, bark mass concentration)比值R=BMC PAH /BMC PER 来评价大气PAHs污染程度,消除了因气候和树木种类等因素引起的大气PAHs污染程度评价的“不确定性”,客观地反映了不同地区大气PAHs污染的“相对水平”。研究结果发表于Environ Sci Technol

通过所建立的p LVI-GC/ECNI-qMS分析平台检测树木表皮中的POPs含量和KBA值,并应用于我们通过基础研究 建立的POPs在大气和表皮间分配的定量关系模型,得到了大气POPs的实际含量(ng/m3)。全国性采集不同地点的树木表皮样品,分析其中POPs的含量,实现了大气POPs污染的“空间分辨”监测并对大气POPs污染程度作出了客观评价。相关研究结果发表于Environ Sci Technol

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中国大陆大气POPs 污染的空间分布

树木表皮在树木生长过程中因不规则树干的形成、树干枝杈的合拢、树木表皮物理损伤后的 “愈合”等因素可被包裹在树干中,树木表皮“记录”的大气POPs污染状况信息可被“封存”于树干中;“封存”时间可通过环绕在其周围的“年轮”来确定和分辨。我们定义包裹于树干中的树木表皮为“时间隧道”。 

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封存于树木中的“时间隧道”

通过树木“时间隧道”中所“记录”的POPs的分析,量化追溯了大气 POPs 的污染历史和演变过程,填补了我国大气 POPs 污染的历史数据和大气“环境背景值”的空白。我们曾经分析了采集于福建天宝岩国家自然保护区的“水青冈树木时间隧道”样品中的PAHs,揭示了我国东南地区大气PAHs污染“130年”的历史演变趋势。通过分析2005年采集于江西省的杉树 “时间隧道”样品,获得了我国东南地区1952-2005年间大气有机氯农药、多氯联苯、溴代阻燃剂污染演变趋势的大量历史数据。

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中国东南地区大气POPs 污染的历史演变趋势

(四) 新型色谱分离介质的制备与分析仪器部件和整机的制作

整体柱是色谱核心部分-色谱柱的最新发展方向。我们合成了以甲基丙烯酸酯系列化合物为单体的系列聚合物毛细管整体柱。通过调整共聚物的组成,改变交联剂中二甲基丙烯酸酯间的烷基链长度和取代基的种类,来调控整体柱柱床的孔径分布和表面化学性质,并采用扫描电镜、氮吸附法和压汞法等测试手段表征和解析材料的宏观和微观物理化学性质及结构特性,系统评价了其色谱性能,并且实现了对常见小分子到生物大分子的快速高效分离。

另外,我们又合成了以苯乙烯系化合物为聚合单体的聚合物毛细管整体柱。以二甲亚砜与正十二醇的混合物为致孔剂,苯乙烯与二乙烯苯作为聚合反应单体混合物进行在柱聚合以制备苯乙烯型毛细管整体柱。调整致孔剂组成、单体/交联剂比例及致孔剂含量等聚合反应参数以提高分离效能,实现常见小分子和生物大分子的快速分离。

新型分析仪器的研制是分析化学的重要任务之一,也是分析化学原理创新和技术发展的重要保障之一。我们研究小组在开展环境分析方法学研究的同时十分注重分析仪器的“部件”和“整机”的研制。研制了色谱与原子光谱/质谱联用的“光催化/光诱导还原”接口、程序升温式“热扩散”接口和用于流动体系的“气-液分离器”以及“便携式液相色谱仪”整机。还研制的“便携式色谱仪”(40×30×18cm)配备自主设计制作的双大扭矩注射泵,可以实现梯度洗脱,并可与自制的毛细管整体柱配合使用;自主设计制作了紫外-可见吸收/荧光双功能检测器并编写了控制、数据采集和后处理软件。其性能与国外进口的大型台式HPLC的性能相当,并且便于携带,以锂电池供电,适于野外现场使用。我们研制的仪器和部件有效地保障了复杂样品分析原理与方法的创新发展和应用。

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2004年以来,应邀在国际(9次)和国内(3次)学术会议上做Keynote或特邀报告、应邀为国际学术期刊撰写论文(5次)和应邀参加 IUPAC 的国际合作,是IUPAC化学蒸气发生指导规范全球 6 人撰写小组成员。在本研究领域的国际主流学术期刊Anal Chem 2008Environ Sci Technol 2004, 2006, 2008;Metallomics 2009;J At Anal Spectrom 2004, 2005, 2007 ( 2 ), 2008Spectrochim Acta B 2006;J Am Soc MassSpectrom 2007, 2008;J Chromatogr A 2005, 2009;Talanta 2006( 2 ), 2007Anal Bioanal Chem 2005, 2007上连续发表深入系统的研究工作;获得国家发明专利4项,实用新型专利3项。

在现有研究工作的基础上,瞄准科学发展前沿,面向国家需求,继续开展多学科交叉研究,我们将来主要准备开展下述两个方面的研究工作:

(一)金属组学研究

   金属组学研究内容有三个层次:1)环境介质/生物组织(细胞)中金属/类金属元素的含量、形态和分布及它们之间的相互作用;2)金属/类金属元素与环境介质/生物组织(细胞)中活性分子的相互作用;3)污染环境中金属/类金属污染元素对生命过程的影响。每一个层次研究的开展都有赖于高灵敏度高选择性的分析检测技术和相应分析策略的发展。我们的首要任务是开展适于复杂体系分析的采样、富集/分离和检测的方法学研究,进而探索污染环境中金属/类金属元素对生命体的胁迫作用机制、生命体适应/抵御污染元素暴露的自身调控方式和路径,了解污染环境胁迫下生命体的基因唤醒/突变和由此引起的特异多肽/酶/蛋白的过度/抑制表达机制,发现生命体的标志生物分子或特定标志生物分子集群。

(二)污染环境的立体监测分析方法学

环境污染的后果之一是对生长在环境中的生物和人类产生危害。POPs的生物蓄积/放大特性,使环境中生存的动/植物成为环境污染监测的“哨兵”。动/植物体(或组织)内POPs的“逸度”(Fugacity)一般较水/沉积物/土/大气的“逸度”低1到3个数量级,而且其中的污染物浓度反映了长期的环境污染状况,这对处于动态的复杂环境体系污染程度的客观评价至关重要,特别是对 “新污染物”的发现具有十分敏感的指示作用。发展包括非生命介质(水/沉积物/土/大气)和生命介质(动/植物或其组织)的环境污染“立体监测”策略是全面客观评价环境污染状况和风险以及污染环境对生命体胁迫作用研究的有效途径。依据原子光谱/质谱与多维色谱的集成建立“立体监测”技术平台,通过发展以生命和非生命介质为多维检测对象的“立体监测”应用平台,构建环境污染“时空分辨”的“立体监测”数据平台,建立平衡/稳态模型,探索污染物蓄积/富集/代谢途径。“立体监测”平台的构建和分析方法学的发展,将不仅提供环境污染状况的客观情报,而且对污染物在环境介质和生命体中的分布、迁移转化和与生命活性物质相互作用(毒理效应)的规律研究也将发挥不可替代的集成作用。在建构“立体监测”平台、发展相应分析方法学、建立环境介质和动/植物体间平衡/稳态模型、开展环境立体监测的基础上,注重POPs对人类健康影响的研究。